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Tissuelyser-48利用CTAB法在多樣品組織研磨機(jī)上提取植物總DNA

更新時(shí)間:2024-03-06   更新時(shí)間:2024-03-06   點(diǎn)擊次數(shù):3114次
  利用CTAB法在多樣品組織研磨機(jī)上提取植物總DNA(以下內(nèi)容只是簡單介紹,詳細(xì)情況,可咨詢本公司,)
  一、實(shí)驗(yàn)試劑:
  1.CTAB抽提液:
  2%(w/v)CTAB
  100mmol/LTris-HCl(pH8.0)
  20mmol/LEDTA(pH8.0)
  1.4mol/LNaCl
  抽提含多酚較多的植物材料時(shí)(比如木本植物),上述抽提液中可另加入2%的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。
  抽提液于室溫保存,可在幾年內(nèi)保持穩(wěn)定。臨用之前向裝有上述抽提液的試管中加入約2%-3%(v/v)的β-巰基乙醇。
  2、醋酸鈉:
  3mol/LNaAc
  用冰乙酸調(diào)pH值至4.8-5.2。
  3、TE溶液:
  4、其它:
  無水乙醇,異丙醇,75%乙醇,酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),氯仿:異戊醇(24:1),β-巰基乙醇,重蒸水。

組織研磨

  二、實(shí)驗(yàn)步驟

  1.樣品研磨
  1)取1g的樣品放入2mlepp管中
  2)加入1-2粒5mm研磨珠
  3)加入1ml的CTAB抽提液
  4)將加有樣品的epp管放入多組織研磨儀的適配器中,蓋好
  5)將研磨頻率調(diào)到60Hz,設(shè)定研磨時(shí)間為90秒(可根椐樣品的研磨的難易程度來調(diào)節(jié),此數(shù)據(jù)是以銀杏落葉為樣本得出)
  6)啟動(dòng)研磨儀對(duì)樣品進(jìn)行研磨(根據(jù)不同的樣品,本身性質(zhì)不同,需要對(duì)研磨頻率和研磨時(shí)間進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整)
  2.DNA的粗提
  1)將研磨好的樣品取出于65℃水浴45min,中途間隔(輕柔)振蕩三次混勻
  2)冷卻后加入等體積氯仿:異戊醇(24:1),輕柔顛倒混勻使乳化10min
  3)7000g-8000g離心10min(18-20℃)
  4)吸取上清于另一干凈的離心管中
  5)(根據(jù)需要可用氯仿:異戊醇如上法重復(fù)抽提一次,吸取上清)
  6)加入與上清液等體積(且已于-20℃預(yù)冷的異丙醇,顛倒混勻,約1至2分鐘后應(yīng)有白色絮狀沉淀出現(xiàn)(若沒有,則加入上清液1/5至1/10體積的pH4.8-5.2的3MNaAc,混勻,于-20℃冰箱中沉淀30min)
  7)離心法沉淀DNA
  8)在75%乙醇中漂洗DNA數(shù)分鐘以上,用Tip頭吸干乙醇
  9)用1ml75%乙醇再漂洗一次
  10)沉淀于室溫或64℃以下的恒溫箱中干燥片刻至剛出現(xiàn)半透明,不要過度干燥
  11)用50μlTE溶解沉淀,可用65℃水浴助溶,DNA粗提物可用于粗略PCR等。

組織研磨

  3.DNA的純化

  1)向TE溶解的DNA粗提物中入4-10μlRNaseA(約40-100μg)
  2)于37℃酶解RNA1hr或65℃酶解RNA30min以上
  3)加入50μl酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),輕輕顛倒混勻10min
  4)10000g以上常溫離心10min,吸取上清
  5)加入50μl仿氯:異戊醇(24:1)輕輕顛倒10min
  6)10000g以上常溫離心10min,吸取上清(根據(jù)需要可重復(fù)用氯仿:異戊醇如上法再抽提1-2次,以充分去除蛋白和酚)
  7)向上清中加入1/5-1/10體積的pH4.8-5.2的3MNaAc,并加入2.5倍體積無水乙醇,于-20℃沉淀30min以上
  8)12000g、4℃低溫離心10min,吸干液體
  9)沉淀用75%乙醇漂洗二次
  10)沉淀于室溫或64℃以下恒溫箱中干燥片刻至剛開始出現(xiàn)半透明狀,勿過度干燥加入50μl重蒸水溶解DNA,可于65℃水浴助溶
  11)取5μlDNA電泳檢查DNA的質(zhì)量
  12)100-500倍稀釋后于分光光度計(jì)上測(cè)定OD260及OD280,分析DNA的濃度和質(zhì)量
  13)保存DNA于-20℃
  補(bǔ)充:如果需要提取的樣品比較多(比如1g),研磨好的樣品在后續(xù)的提取中,需要轉(zhuǎn)移到大的epp管中,研磨時(shí)可以加入較少的抽提液,研磨完畢按照1g樣品10ml提取液補(bǔ)充抽提液,進(jìn)行后續(xù)的操作。

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